1. 准备材料
材料和试剂
a）特级胎牛血清。
b）RPMI 1640培养基。
c）2%FBS完全培养液：取特级胎牛血清10mL，5ml100✖️青链霉素，加入485mL RPMI 1640无血清培养基中，混匀，即得。
d）VERO细胞，代次不超过50代。
e）1×PBS。
f）含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液。
设备和用具
a）超净工作台：洁净级别为A级。
b）二氧化碳恒温培养箱：CO2体积分数为(5±0.1)%，温度37.0℃。
c）离心机。
d）微量移液器：0.5-10μL，20-200μL，100-1000μL。
e）倒置相差显微镜。
f）血球计数板、盖玻片。
g）水浴锅。
h）一次性无菌吸管、一次性无菌离心管。
i）酒精棉球、酒精灯。
定义
细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的适应期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平衡期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的适应期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平衡期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。
2. 实验步骤
1. 细胞放倒置显微观察下细胞形态是否典型，是否有污染发生，发现污染丢弃细胞，及时溯源培养基和用具排查污染情况。
2.当细胞铺满培养器皿底部85%左右，细胞传代。用无菌低类毒素的DPBS清洗细胞一次，加入适量0.25%胰蛋白酶溶液消化处于对数生长期的VERO细胞，显微镜下观察细胞消化情况，防止过度消化，以免损伤细胞，加入完全培养基中和胰酶，收集消化的细胞于15mL离心管中。
3.800-1200rpm离心5min，如果消化液不含EDTA也可以不离心，直接如果弃上清。
3.加入RPMI 1640培养基（含2%小牛血清），制备单细胞悬液。
4.吹打均匀后对细胞进行计数。
5.按2×104-5×104个/mL的细胞浓度接接种到培养器皿中。接种量应适当，不能过少或过多，过少将使细胞生长周期延长，过多将导致细胞在实验未完成前即需传代，这两种情况下所得到的生长曲线均不能较准确地反映细胞的生长状况。
6.每天用胰蛋白酶溶液对其中3孔细胞进行消化，以1×PBS溶液稀释，镜下计数。
7.计算3孔培养细胞数的平均值。
8.连续7d按上述方法消化3孔细胞并进行计数，算平均值。
9.以培养时间（d）作为横坐标、细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
细胞生长曲线
倍增时间
参考文献
[1] 国家药典委员会. 《中华人民共和国药典：2020年版. 三部：3604 新生牛血清》[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020.
[2]R.Ian Freshney et al. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(7th Edition)[M]. 2019.
[3] 细胞生物学实验技术[M]. 章静波, 黄东阳, 方瑾, 主编.化学工业出版社.2011.
[4] Costar® PLATE,24WL,TCT,PS,W/LID,S,IND：Certificate of Compliance—Lot ID：19224601.
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